Laporan Mikrobiologi

BAB I

PENDAHULUAN

Mikrobiologi merupakan ilmu biologi yang berorientasi pada mikroorganisme. Objek kajian mikrobiologi biasanya adalah semua makhluk hidup yang perlu dilihat dengan mikroskop, khususnya bakteri, fungi, alga, protozoa dan archaea. Mikroorganisme terdapat berbagai macam di alam ini dengan jumlah yang besar. Mikroorganisme dapat tumbuh dan berkembang biak asalkan kebutuhan nutriennya tercukupi serta kecocokan dengan mediumnya.

Roti merupakan panganan yang terbuat dari tepung terigu dan air yang difermentasikan oleh ragi. tetapi ada juga yang tidak menggunakan ragi. Namun kemajuan teknologi manusia membuat roti diolah dengan berbagai bahan seperti garam, minyak, mentega, ataupun telur untuk menambahkan kadar protein di dalamnya sehingga didapat tekstur dan rasa tertentu.

Tujuan dari praktikum mikrobiologi ini adalah untuk mengetahui bagaimana cara sterilisasi alat-alat dan medium, mengetahui cara pembuatan medium, mengetahui struktur mikroorganisme yang tumbuh pada medium, mengetahui cara perhitungan bakteri dengan metode hitung cawan serta pewarnaan gram pada mikroba. Manfaat dari praktikum mikrobiologi adalah praktikan dapat mengetahui bagaimana pertumbuhan serta perkembangan bakteri yang terdapat pada medium karena bakteri memiliki berbagai macam peran bagi kehidupan makhluk hidup.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1.            Sterilisasi

Sterilisasi adalah suatu proses penghancurkan segala bentuk-bentuk kehidupan (Pelczar, 2008). Sterilisasi adalah perlakuan yang membebaskan benda yang teliti dari semua organisasi hidup. Sterilisasi dicapai dengan menggunakan pemanasan basah, pemanasan kering, filtrasi, penyinaran atau bahan-bahan kimia (Fardiaz, 1993). Medium dan alat-alat yang kita pergunakan dalam inokulasi jika tidak steril tidak akan mungkin memperoleh biakan bakteri yang diinginkan. Selain itu juga, dalam sterilisasi harus menguasai teknik inokulasi agar mendapat hasil pengamatan yang baik. Sterilisasi yang selanjutnya adalah sterilisasi secara kimia. Sterilisasi ini menggunakan disinfektan, larutan alkohol, larutan formalin  (Dwidjoseputro, 2005).

2.1.1.      Sterilisasi kering

Sterilisasi kering dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu menggunakan api dan oven. Peralatan kaca, serbuk, minyak dan sebagainya yang tahan terhadap pemanasan, dimasukkan ke dalam oven pada temperatur 160⁰ selama 2 jam atau 170⁰C selama 1 jam, hal ini bergantung kepada banyak sedikitnya muatan yang dimasukkan ke dalam oven (Dwidjoseputro, 2005). Pensterilan alat – alat dapat pula dilakukan dengan gas etilen oksida. Hal ini harus dikerjakan dengan hati – hati, karena ada bahaya letusan (Purwoko, 2007).

2.1.2.      Sterilisasi basah

Medium yang disterilkan sebaiknya ditempatkan dalam beberapa botol yang agak kecil. Biasanya autoklaf sudah diatur sedemikian rupa, sehingga pada suhu tersebut tekanan ada sebesar sebesar 2 atm atau 15 lb/in²  pada suhu 121⁰C (Dwidjoseputro, 2005). Jika medium mengandung vitamin, gelatin, atau sebangsa gula, maka setelah sterilisasi dalam autoklaf, medium tersebut haruslah segera didinginkan sesudah dikeluarkan dari autoklaf. Perbuatan ini perlu untuk menghindari terurainya zat–zat tersebut. Medium yang sudah steril dapat disimpan dalam lemari es (Purwoko, 2007).

2.2.            Medium dan Larutan Pengencer

Medium adalah bahan yang mengandung campuran nutrisi yang bermanfaat untuk menumbuhkan mikroba. Medium ada yang alami dan ada medium berupa buatan manusia. Contoh medium buatan manusia adalah medium cair, medium padat dan medium setengah padat. Medium cair digunakan untuk menumbuhkan bakteri dan juga fermentasi. Medium padat digunakan untuk menumbuhkan mikroba pada permukaan (Dwidjoseputro, 1994).  Pada saat penyimpanan, media tidak boleh dibekukan. Hal ini dilakukan untuk menghindari kondensasi dan menetes ke permukaan agar yang dapat memfasilitasi pergerakan organisme dalam kolon.

Larutan pengencer merupakan larutan yang digunakan untuk mengencerkan larutan dengan perbandingan pengenceran tertentu. Pengenceran dengan larutan pengencer diperlukan agar nantinya diperoleh pertumbuhan bakteri yang tidak konfluen hingga koloninya mudah untuk dihitung (Sandjaja, 1992).

2.2.1.      Medium Nutrien Agar (NA)

NA adalah suatu larutan biak yang dapat dibuat dari senyawa Nutrient Broth yang didalamnya mengandung ekstrak daging dan pepto ditambah 1,5% agar dipakai untuk menumbuhkan mikroorganisme (Schlegel dan Schmidt, 1994). NA merupakan salah satu teknik yang sangat baik untuk memisahkan mikroba karena NA itu bernuansa basa sehingga dapat diketahui masing-masing morfologinya (Harsono, 2001).

Nutient Agar adalah salah satu medium padat yang memiliki komposisi yaitu agar-agar yang telah dipanaskan dan mencair dengan suhu 95 (Dwijoseputro, 1994). Agar-agar adalah zat pengental dan bukan sebagai sumber makanan bagi bakteri. Bahwa agar-agar digunakan untuk membuat medium padat, agar larut dan menjadi padat pada suhu 45 . NA lebih bersifat umum sehingga mikroba banyak tumbuh pada media ini (Amelia et al, 2005). Na merupakan salah satu media yang umum digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air, sewage, produk pangan, un tuk membawa stok kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni. NA juga digunakan untuk media kapang dan khamir     (Sumanti, 2008).

2.2.2.      Medium Potato Dextrose Agar (PDA) dan Acidified Potato Dextrose Agar (APDA)

Medium APDA adalah salah satu dari medium untuk proses menumbuhkan mikrobia. APDA merupakan medium yang berkomposisi kentang, dextrose dan asam tartarat. APDA tidak bersifat umum seperti NA karena tidak semua mikrobia dapat tumbuh pada medium ini. Medium APDA termasuk ke dalam medium yang padat sehingga dapat membentuk koloni mikroba yang dapat dilihat dan dihitung, jika diinokulasi di dalam medium APDA, bakteri anaerob akan tumbuh mengelompok  pada dasar medium, bakteri anaerob fakultatif akan tumbuh tersebar diseluruh medium, bakteri mikroarofil akan tumbuh mengelompok sedikit di bawah permukaan medium, sedangkan bakteri aerob akan tumbuh pada permukaan medium (Dwidjoseputro, 1994). Medium ini digunakan untuk isolasi bakteri, hasilnya dinyatakan dalam jumlah koloni yang didapatkan nantinya. Medium ini sangat diperlukan untuk mempelajari cirri-ciri koloni, sifat-sifat biokimia, morfologi, reaksi pengecatan, reaksi imunologi dan ketentraman bakteri terhadap zat antibakteri. Pembuatan medium APDA dapat dilakukan dengan serangkaian cara mulai dari pembuatan PDA hingga pencampurannya dengan asam tartarat (Irianto, 2010). Media APDA berfungsi untuk menumbuhkan dan menghitung jumlah khamir dan yeast yang terdapat dalam suatu sampel. Khamir dan yeast akan tumbuh dengan optimal pada media yang sesuai (Sumanti, 2008).

Medium harus mengandung semua nutrisi yang mudah digunakan oleh mikroorganisme. PDA dibuat untuk menumbuhkan jamur. Hal itu dekarenakan jamur membutuhkan medium yang mengandung karbohidrat, dan pada medium ini terdapat kentang (sumber karbohidrat) sebagai media yang cocok untuk menumbuhkan jamur. PDA yang digunakan untuk kultivasi dan identifikasi jamur sehingga mempermudah dalam morfologinya (Fardiaz, 1994). PDA terbuat dari kentang dengan campuran dextrose dengan menggunakan perbandingan yang benar. Didalam ilmu biologi disebutkan bahwa bakteri hidup disuasana asam, hal ini menunjukan bahwa PDA cocok untuk mengembang biakkan mikroba      (Penn, 1991).

2.3.            Metode Hitung Cawan

Prinsip dari metode hitungan cawan adalah jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar maka sel mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk menentukan jumlah mikroba karena hanya sel yang hidup yang dapat dihitung, beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus, dan dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba karena yang terbentuk mungkin dapat berasal dari satu sel mikroba dengan penampakan pertumbuhan spesifik (Fardiaz, 1992). Supaya perhitungannya teliti, maka diambil dari cawan petri yang jumlah mikrobanya antara 30 - 300 (Schlegel dan Schmidt, 1994).

Metode hitungan cawan memiliki beberapa kelemahan, yaitu hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk satu koloni, medium dan kondisi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai yang berbeda, mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak dan jelas, tidak menyebar, serta memerlukan persiapan dan waktu inkubasi yang lama supaya pertumbuhan koloni dapat dihitung (Fardiaz, 1999). Contoh yang alami misalnya pada tanah yang mengandung bermacam jenis mikrooganisme, tidak mungkin untuk menghitung semua mikrooganisme yang terdapat didalamnya dengan cara viable plating. Kekurangan ini dapat dijadikan sebagai suatu keunggulan jika kita ingin mengamati populasi mikroorganisme yang lebih spesifik (Harmita dan Radji, 2006)

2.4.            Morfologi Bakteri

2.4.1.   Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus mempunyai bentuk coccus, berukuran besar, biasanya Staphylococcus aureus terdapat pada rongga hidung manusia maupun pada beberapa jenis hewan tertentu, juga terdapat pada kulit. Staphylococcus aureus merupakan penyebab umum pada keracunan pangan (Schlegel, 2000). Staphylococcus aureus mempunyai susunan yang menyerupai buah anggur, perkiraan diameternya 0,8 μ, tumbuh pada media yang mempunyai temperatur 37⁰C, tumbuh pada temperatur optimal 35⁰C (Smith, 1960).  Bentuk Staphylococcus bola sampai lonjong dengan diameter 2 μm dan mudah tumbuh dalam medium yang sederhana (Pelczar, 2008).

2.4.2.   Escherichia coli                              

Escherichia coli memiliki bentuk batang pendek dan habitat utamanya adalah usus manusia dan hewan. Escherichia coli dipakai sebagai organisme indikator karena Escherichia coli terdapat dalam jumlah yang banyak menunjukkan bahwa pangan atau air telah mengalami pencemaran          (Dwiloka, 2000). Morfologi Escherichia coli antara lain berbentuk bacill pendek, mempunyai lebar antara 0,4 sampai 0,7 μ, panjang antara 1 sampai 4 μ. Pada  medium  agar  cawan  koloninya mempunyai ukuran 2 sampai 3 mm dalam waktu 48 jam (Dwidjoseputro, 2005).

2.5.            Pewarnaan Gram

Prosedur pewarnaan gram yaitu salah satu tehnik pewarnaan diferensial yang paling penting dan paling luas digunakan untuk bakteri. Proses ini yaitu olesan bakteri yang terfiksasi  terlebih dahulu kemudian dikenai larutan-larutan berikut antara lain Gram A, Gram B, Gram C dan Gram D. Gram A terdiri dari ungu kristal 90% sebanyak 2 gram, etanol 95% sebanyak 20 gram, amonium oksalat 0,8 gram, serta aquades 80 gram. Gram B terdiri dari kristal iodium 1 gram, kalium iodida 2 gram, serta aquades 300 ml. Gram C terdiri dari etanol 95%, dan Gram D terdiri dari larutan safranin 2,5% dalam etanol 95% sebanyak 10 ml, serta aquades 100 ml. Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi menjadi dua kelompok. Salah satu di antaranya, bakteri Gram positif yaitu apa bila zat warna tambahan terhapus, sehinnga yang tampak ialah zat wana yang asli (ungu), sedangakan Gram negatif  yaitu apa bila zat warna tambahan (merah) bertahan hingga zat warna asli tidak tampak, (Dwijoseputro, 1994).

Pada umumnya bakteri Gram positif lebih peka terhadap fenol, penisilin, dan resisten terhadap streptomisin (Dwijoseputro, 1994). Untuk mendapatkan sebuah hasil yang terbaik dari kegiatan pewarnaan Gram, dapat diperoleh dengan mengunakan zat-zat warna dari golongan paraosalina, seperti metil violet dan kristal violet (tetrametilpararosalina) (Irianto, 2006).

BAB III

MATERI DAN METODE

Praktikum Mikrobiologi yang dilaksanakan pada hari Jum’at tanggal 25 Mei 2012 pukul 07.00-11.00 WIB dengan materi Sterilisasi, Medium dan Larutan Pengenceran serta pada hari Sabtu tanggal 26 Mei 2012 pukul 07.00-09.00 WIB dengan materi Metode Penghitungan Cawan dan Pewarnaan Gram yang di laksanakan di Laboratorium Fisiologi dan Biokimia Ternak Fakultas Peternakan dan Pertanian Universitas Diponegoro, Semarang.

3.1.                 Materi

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum mikrobiologi ini adalah cawan petri, pipet volum, erlenmeyer, beker glass, tabung reaksi, waterbath, oven, autoclave, inkubator, timbangan, penghisap, loop, api bunsen, aluminium foil, kertas pembungkus, pisau, kapas, tissu serta alat tulis. Bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah Nutrien Agar (bubuk), kentang, dextrose, asam tartarat, agar (bubuk), aquades, Gram A (violet kristal 90%, etanol 95%, amonium oksalat, aquade), Gram B (kristal iodium, kalium iodida, aquades), Gram C (etanol 95%) dan Gram D (larutan safranin, aquades).

3.2.                 Metode

3.2.1.           Sterilisasi

3.2.1.1.     Sterilisasi kering, metode yang dilakukan pada praktikum ini pertama-tama menyiapkan pipet, cawan petri serta alat gelas lainnya sesuai dengan kebutuhan. Kemudian membersihkan cawan petri menggunakan kapas dengan membasahi menggunakan alkohol untuk menghilangkan lemak dan kotoran yang menempel pada cawan petri, kemudian membungkusnya dengan kertas pembungkus. Membersihkan pipet volum serta menyumbat bagian pangkal pipet menggunakan kapas, kemudian membungkusnya menggunakan kertas pembungkus. Memasukan cawan petri, pipe dan erlenmeyer pada oven selama 1 jam dengan suhu 170^oC. Setelah selesai, mengeluarkan cawan petri dan pipet dari oven, tunggu hingga suhu turun sebelum menggunakannya.

3.2.1.2.     Sterilisasi basah, metode yang dilakukan pada praktikum ini pertama-tama memasukkan medium sebelum mensrterilkannya kedalam erlenmeyer serta larutan pengencer kemudian tutup rapat menggunakan kapas. Memasukan erlenmeyer dan tabung reaksi ke dalam autoclave, kemudian menutup autoclave hingga rapat.menyalakan autoclave, menunggu hinga manometer dan termometer menunjukan tanda sterilisasi atau pada suhu121^oC dengan tekanan 2 atam, mendiamkannyanya selama 15 menit. Setelah 15 menit menunggu hingga tekanan autoclave berkisar 0,5 atm, membuka katup pengaman dan membiarkan hingga autoclave tidak bertekanan, setelah itu membuka autoclave dan medium. Untuk medium berupa agar, untuk menurunkann suhunya dan menjaga agar tidak membeku maka memasukannya kedalam inkubator bersuhu 55^oC, sebelum digunakan.

3.2.2.           Pembuatan medium

3.2.2.1.     Medium Nutrien Agar (NA), metode yang dilakukan pada praktikum ini pertama-tama menimbang nutrien agar sebanyak 2,3 gram per 100 ml, melrutkannya dalam aquaddes. Mengaduk menggunakan pengaduk magnetik stirrer dan melakukan sterilisasi menggunakan autoclave.

3.2.2.2.     Medium Potato Dextrose Agar (PDA) dan Acified Potato Dextrose Agar (APDA), metode yang dilakukan pada praktikum ini pertama-tama mengupas kentang kemudian mencucinya menggunakan air hingga bersih. Mengiris kentang dengan ukuran 1x1 cm. Menimbang kentang sebanyak 250 g. Memasukan kentang kedalam beker glass, kemudian menambahkan 500 ml aquades, lalu menutupnya menggunakan aluminium foil serapat mungkin. Memanaskannya diatas pemanas hingga mendidih. Mengambil filtrat kentang dengan cara menyaringnya menggunakan kain saring. Setelah filtrat terkumpul, mengukur volumenya untuk membuat PDA dengan komposisi 100 ml filtrat kentang, 2 g dextrose, 2 g agar serta pH 6,8 – 7,2. Setelah itu, membuat medium APDA dengan menyiapkan larutan asam tartarat 10%. Mensterilkan medium PDA dan larutan asam tartarat 10% dalam autoclave pada suhu 121^oC tekanan 2 atm selama 12 menit. Kemudian memasukkan medium PDA dan larutan asam tartarat 10% kedalam inkubator bersuhu 50^oC. Setelah mencapai suhu 50^oC menambahkan dengan pipet ukur steril larutam asam tartarat 10% kedalam medium PDA secara aseptis. Maka menghasilkan medium APDA.

3.2.3.           Metode hitungan cawan

Metode yang dilakukan pada praktikum ini pertama-tama menyiapkan serta memberi label larutan pengencer dan cawan petri steril sesuai dengan pengenceran dan pemupukan. Melakukan pengenceran hingga tinglat pengenceran yang ditentukan. Melakukan pencewanan pada 3 tingkat penenceran terakhir.menuangkan 10  ml medium agar kedalam cawan petri kemudian menggoyangkannya membentuk angka delapan hingga sampel merata. Setelah medium membeku, melakukan inkubasi dengan posisi terbalik pada suhu ruangan selama 24 – 48 jam. Menghitung jumlah koloni yang tumbuh pada cawan dan melaporkan jumlah koloni per ml menurut standar yang ditetapkan.

3.2.4.           Pewarnaan gram

3.2.4.1.     Kultur cair, metode yang dilakukan pada praktikum ini pertama-tama menyebarkan sat atau lebih loop kultur cair pada kaca objek sehingga mencapai diameter kira-kira 1 – 1,5 cm² kemudian mengeringkan / menfiksasi dengan api kecil. Meneteskan Gram A pada preparat lalu mendiamkannya selama 1 menit. Membilas kaca objek dengan aquades dengan memiringkan kaca objek. Membuang sisa air yang tertinggal kemudian menetesi dengan Gram B selama 2 menit kemudian membilasnya dengan aquades, lalu menghilangkan warna dengan Gram C hinggga warna biru tidak luntur lagi. Membilas kembali dengan aquades, kemudian menetesi dengan Gram D selama 30 detik. Membilas dengan air dan mengeringkan menggunakan tisu. Setelah selesai periksalah pada mikroskop hingga perbesaran 100 x.

3.2.4.2.     Kultur padat, metode yang dilakukan pada praktikum ini pertama-tama memberi air sebanyak 1- 2 tetes pada kaca objek dan mengambil sedikit mikroba menggunakan ujung loop, kemudian menyebarkannya diatas kaca objek sehingga memiliki diameter 1 – 1,5 cm². Suspensi yang terbentuk tidak boleh keruh untuk mencegah terbentuknya preparat yang terlalu tebal. Kemudian mengeringkan / menfiksasi dengan api kecil. Meneteskan Gram A pada preparat lalu mendiamkannya selama 1 menit. Membilas kaca objek dengan aquades dengan memiringkan kaca objek. Membuang sisa air yang tertinggal kemudian menetesi dengan Gram B selama 2 menit kemudian membilasnya dengan aquades, lalu menghilangkan warna dengan Gram C hinggga warna biru tidak luntur lagi. Membilas kembali dengan aquades, kemudian menetesi dengan Gram D selama 30 detik. Membilas dengan air dan mengeringkan menggunakan tisu. Setelah selesai periksalah pada mikroskop hingga perbesaran 100 x.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1.            Sterilisasi

Berdasarkan hasil praktikum diperoleh hasil bahwa sterilisasi membutuhkan kesabaran dan ketelitian. Alat-alat dan bahan yang akan digunakan dalam praktikum harus benar -benar steril. Langkah pertama yang harus diambil sebelum mengadakan inokulasi adalah mensterilkan medium serta alat-alat perlengkapannya. Pada sterilisasi kering dipergunakan untuk mensterilkan alat-alat praktikum yang terboat dari bahan kaca dengan menggunakan oven dengan suhu 170⁰C selama 1 jam sedangkan sterlisasi basah dipergunakan untuk mensterilkan medium yang digunakan sebagai media biakan mikroba dengan menggunakan autoclave selama 15 menit dengan tekanan 2 atm  Hal ini sesuai dengan pendapat Dwidjoseputro (2005) yang menyatakan bahwa medium yang disterilkan ditempatakan di dalam autoklaf  selama 15 menit, hal ini tergantung kepada banyak sedikitnya barang yang disterilkan. Biasanya autoklaf sudah diatur sedemikian rupa, sehingga pada suhu tersebut tekanan ada sebesar sebesar 2 atm atau 15 lb/in²  pada suhu 121⁰C.

4.2.            Medium

4.2.1.      Pembuatan medium Nutrient Agar (NA)

Berdasarkan hasil praktikum diperoleh hasil bahwa medium adalah bahan yang mengandung campuran nutrisi yang bermanfaat untuk membunuh mikroba. Medium Nutrient Agar (NA) masuk ke dalam medium khusus karena dibuat sebagai tempat menumbuhkan mikroba yang sudah diketahui komposisi pembuatannya. NA dibuat dengan komposisi agar-agar yang sudah dipadatkan sehingga NA juga bisa disebut dengan nutrient padat yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri. Fungsi agar-agar hanya sebagai pengental namun bukan zat makanan pada bakteri, agar dapat mudah menjadi padat pada suhu tertentu. Hal ini sesuai dengan pendapat Dwidjoseputro (1994) yang menyatakan bahwa medium Nutrient Agar adalah salah satu medium padat yang memiliki komposisi yaitu agar-agar yang telah di panaskan dan mencair dengan suhu 95 . Agar-agar adalah zat pengental dan bukan sebagai sumber makanan bagi bakteri. Menurut pendapat Amelia et al (2005) yang menyatakan bahwa agar – agar digunakan untuk membuat medium padat, agar larut dan menjadi padat pada suhu 45⁰C. NA lebih bersifat umum sehingga mikroba banyak tumbuh pada media ini. Bakteri yang terkandung adalah kapang dan khamir. Hal ini sesuai dengan pendapat Sumanti (2008) yang menyatakan bahwa NA juga digunakan untuk media kapang dan khamir.

4.2.2.      Pembuatan medium Acidfied Potato Dextrose Agar (APDA)

Berdasarkan hasil praktikum diketahui bahwa medium APDA adalah salah satu dari medium untuk proses menumbuhkan mikrobia. APDA medium yang berkomposisi kentang, dextrose dan asam tartarat. APDA tidak bersifat umum seperti NA karena tidak semua mikrobia dapat tumbuh pada medium ini. Medium APDA termasuk ke dalam medium yang padat sehingga dapat membentuk koloni mikroba yang dapat di lihat dan di hitung. Hal tersebut sesuai dengan pendapat Dwidjoseputro (1994) bahwa medium APDA tidak bersifat umum seperti medium padat lainnya karena tidak semua bakteri dapat tumbuh pada medium ini. Percobaan dengan medium APDA dilakukan dengan menambahkan asam tartarat pada PDA setelah itu medium digunakan untuk isolasi bakteri. Hal tersebut sesuai dengan pendapat Irianto (2010) yang menyatakan bahwa medium digunakan untuk isolasi bakteri, hasilnya dinyatakan dalam jumlah koloni yang didapatkan nantinya. Dan pembuatan medium APDA dapat dilakukan dengan serangkaian cara mulai dari pembuatan PDA hingga pencampurannya dengan asam tartarat. Mikroba yang terkandung dalam medium ini adalah khamir. Hal ini sesuai dengan pendapat Sumanti (2008) yang menyatakan bahwa media APDA berfungsi untuk menumbuhkan dan menghitung jumlah khamir dan yeast yang terdapat dalam suatu sampel. Khamir dan yeast akan tumbuh dengan optimal pada media yang sesuai.

4.3.            Metode Hitungan Cawan

            Berdasarkan hitungan cawan yang dilakukan, diperoleh hasil sebagai berikut:

Tabel 1. Metode Hitungan Cawan dengan Sampel Roti

Sampel	Pengenceran					SPC
			10-3	10-4	10-5
Roti (NA) Roti (APDA)			48 10	13 6	8 112		4,8 x 104 1,1 x 107

Sumber: Data Primer Praktikum Mikrobiologi Umum, 2012.

Dari hasil hitungan jumlah koloni dapat dilihat bahwa jumlah koloni yang tumbuh pada medium Roti (NA) semakin sedikit pada pengenceran yang semakin tinggi dari 48 lalu 13 dan 8 dengan bakteri E.coli. Menurut Pelchzar (2006) pengenceran digunakan karena untuk menumbuhkan bakteri pada media yang terbatas tidak mungkin dilakukan penghitungan bakteri yang berjumlah puluhan ribu. Pengenceran ini dimaksudkan untuk mengurangi kepadatan bakteri pada sampel. Hal ini sesuai dengan pendapat Irianto (2010) yang menyatakan bahwa Escherichia Coli tumbuh dengan baik dihampir semua media pembenihan, dapat meragi laktosa, dan bersifat mikroaerofilik. Nutrient Agar (NA) yang digunakan dalam praktikum ini adalah agar. Langkah pertama yang dilakukan dalam praktikum ini adalah dengan menghomogenkan sampel dengan larutan pengencer.

Dari hasil hitungan jumlah koloni dapat dilihat bahwa jumlah koloni yang tumbuh pada medium Roti (APDA) semakin sedikit pada pengenceran yang semakin tinggi dari TDA lau 169 dan 98 dan hasil SPC 1,1 x 10⁷ dan bakteri yang hidup adalah staphylococcus yang hasilnya lebih banyak dari NA. Hal ini sesuai dengan pendapat Fardiaz (1992) yang menyatakan bahwa pati merupakan medium yang baik dalam pembiakan mikroorganisme karena mengandung unsur karbon. Hal ini diperkuat dengan pendapat Irianto (2010) yang menyatakan APDA cocok untuk menumbuhkan bakteri staphylococcus.

4.4.            Pewarnaan Gram

4.4.1.      Bakteri Positif

Berdasarkan hasil pengamatan pewarnaan Gram yang dilakukan terhadap kultur cair Staphylococcus aureus dengan perbesaran 100x, diperoleh hasil sebagai berikut :

Ilustrasi 1. Pewarnaan Gram Positif Negatif

Hasil Pratikum		Pembanding
Keterangan :   Bakteri  : staphylococcus aureus   Bentuk  : Bulat   Koloni  : Memisah   Warana : Ungu   Gram    : Positif		Keterangan :   Bakteri  : staphylococcus aureus   Bentuk  : Bulat   Koloni  :Menggumpal   Warana : Ungu   Gram    : Positif
	Sumber : http://en.wikipedia.org/wiki/            Staphylococcus_aureus	Sumber : data Primer Pratikum Mikro Biologi, 2012

Pewarnaan pada Staphylococcus aureus setelah pengamatan terlihat karakteristik bakteri berbentuk bulat (coccus) membentuk suatu koloni dengan warna dasar unggu, hal ini sesuai dengan pendapat Dwijoseputro (1994), menyatakan bahwa bakteri yang memiliki warna dasar ungu di sebut dengan gram positif. Dan menurut pendapat Pelczar (2006) yang menyatakan sel Staphylococcus sp berbentuk coccus atau bulat dengan ukuran 0,3–2,2 μm x 1,27–7,0 μm, bakteri ini termasuk bakteri yang mempunyai gram positif.

4.4.1.      Bakteri Negatif

Berdasarkan hasil pengamatan pewarnaan Gram yang dilakukan terhadap kultur cair Escherichia Coli  dengan perbesaran 100x, diperoleh sebagai berikut :

Ilustrasi 2. Pewarnaan Gram Negatif Bakteri

Hasil Pratikum		Pembanding
Keterangan :   Bakteri  : Escherichia Coli   Bentuk  : Batang   Koloni  : Menggerombol   Warana : Merah Muda   Gram    : Negatif		Keterangan :   Bakteri  : Escherichia Coli   Bentuk  : Batang   Koloni  :Menggerombol   Warana : Merah muda   Gram    : Negatif
	Sumber : www.google.com/Escherichia coli	Sumber : data Primer Pratikum Mikro Biologi, 2012

Pengamatan pada bakteri Escherichia coli terlihat bakteri berwarna merah muda dan berbentuk basil  yang Menurut Irianto  (2006) zat warna yang digunakan dalam pewarnaan sederhana adalah safranin, karbolfuksin encer, air fuksin, tengguli bismack atau pironin B. Kemudian preparat didiamkan selama dua menit dan dilihat dengan menggunakan mikroskop terlihat bakteri yang tidak dapat menahan  zat warna setelah dekolorisasi dengan alkohol akan kembali tidak berwarna dan apa bila di berikan perwarnaan dengan zat warna kontras, akan berwarna sesuai dengan zat warna kontras, dalam hal ini berwarna merah. Bakteri yang memperlihatkan reaksi semacam ini dinamakan bakteri gram negatif.

BAB V

KESIMPULAN

5.1.            Kesimpulan

            Berdasarkan hasil praktikum Mikrobiologi diperoleh kesimpulan bahwa sterilisasi sangatlah dibutuhkan dalam berbagai pekerjaan yang berhubungan dengan mikroorganisme, agar mikroorganisme tersebut dapat berkembang dengan baik. Selain itu, medium yang digunakan pun harus memiliki konsistensi yang baik. Mikroorganisme dapat berkembang pada medium padat. Medium untuk pembiakan dapat dibuat dengan media berupa agar-agar (nutrient agar) dan kentang (acified potati dextrose agar). Hasil perhitungan dengan metode hitungan cawan diperoleh hasil SPC untuk NA adalah 4,8 x 10⁴ dan untuk APDA adalah 1,1 x 10⁷. Mikroorganisme dapat dilihat menggunakan dua metode pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram. Dengan metode pewarnaan gram dapat membedakan antara bakteri gram positif dan bakterri gram negatif.  

5.2.            Saran

Diharapkan pada praktikan lebih memperhatikan ketersediaan alat serta bahan yang akan digunakan dalam praktikum sehingga praktikum dapat berjalan dengan baik, serta diharapkan melakukan pengecekan terhadap alat-alat yang akan digunakan sehingga tidak terjadi kerusakan yang dapat berakibat fatal. Dan tidak lupa meningkatkan komunikasi antara praktikan dan asisten.

DAFTAR PUSTAKA

Amelia,G., R. Handayani, I. Saskiawan, T. Khusniati, A. Cholic. 2005. Isolasi dan Pengujian Aktivasi Enzim Amilase dan Protease Mikroba dari Terasi Asal Kalimantan Timur. Bogor: Pusat Penelitian Biologi.

Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta.

Dwidjoseputro, D.  2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta.

Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan 1. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.

Fardiaz, S. 1993. Analisis Mkrobiologi Pangan. PT. Raja Grafindo Persada, Jakarta.

Fardiaz. 1994. Analisis Mikrobiologi Pangan. Pusat Antar Universitas Pangan dan GIzi Institut Pertanian Bogor, Bogor.

Harmita R. dan Radji, Maksum. 2006. Analis Hayati. Buku Kedokteran EGC, Manurung.

Irianto, Koes. 2006. Mikrobiologi. Yrama Widya, Bandung.

Irianto, Koes. 2010. Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme Jilid I. Yrama Widya, Bandung.

Pelczsar, M dan Chan, ECS.  2008. Dasar – Dasar Mikrobiologi 2. Universitas Indonesia Press, Jakarta

Penn, C. 1991. Handling Laboratory Microorganism. Open University, Milton Keynes.

Purwoko, T. 2007. Fisiologi Mikroba. Bumi Aksara, Jakarta.

Sandjaja, B. 1992. Isolasi dan Identifikasi Mikrobakteria. Widya Medika, Jakarta.

Schlegel, H. G dan Schmidt, K. 1994. Mikrobiologi Umum edisi keenam. Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.

Sumanti, Debby dkk. 2008. Diktat Penuntun Praktikum Mikrobiologi Pangan. Universitas Padjajaran, Jatinangor.

LAMPIRAN

Lampiran 1. Gambar dan Fungsi Alat

Gambar alat	Fungsi alat
Cawan Petri	Sebagai tempat pembiakan mikroba
Mikroskop	Digunakan untuk mengamati mikroorganisme
Api Bunsen	Digunakan untuk mensterilkan alat-alat yang terbuat dari logam serta digunakan ketikan melakukan pengenceran larutan di dekat cawan petri

Lampiran 1. (lanjutan)

Autoclave	Untuk mensterilkan bahan-bahan yang bersifat cair.
Tabung Reaksi	Digunakan sebagai tempar pengenceran larutan.
Magnetic Stirrer Magnetic Stirrer	Untuk mengaduk cairan Nutrient Agar dan Acified Potato Dextrose Agar.
Oven	Digunakan untuk sterilisasi alat-alat yang terbuat dari gelas.

Lampiran 1. (lanjutan)

Erlenmeyer	Untuk menampung larutan Nutrient Agar dan Acified Potato Dextrose Agar.
Bekerglass	Untuk mengukur larutan tertentu dengan tepat.

Lampiran 2. Menjawab Pertanyaan Praktikum Mikrobiologi

A.           Pertanyaan Sterilisasi

1.             Jelaskan perbedaan sterilisasi kering dan sterilisasi basah

2.             Jelaskan tujuan sterilisasi

Jawab :

1.             Sterilisasi kering adalah sterilisasi yang menggunakan alat berupa oven untuk mesterilkan alat gelas seperti cawan petri pada suhu 160°C selama 2 jam atau 170°C selama 1 jam.

Sterilisasi basah adalah sterilisasi yang menggunakan alat autoclave untuk mensterilkan bahan atau medium agar tidak rusak karena pemanasan dan tekanan. Bahan yang disterilisasi berada dalam tabung atau erlemeyer dan ditutup rapat. Sterilisasi ini menggunakan suhu 121°C dengan tekanan 2 atm selama 15 menit.

2.             Tujuan dari sterilisasi adalah membuat alat dan bahan menjadi steril atau terbebas dari mikroorganisme yang bersifat merusak media dan menggangu proses kehidupan mikroba yang akan dibiakkan dan proses yang sedang dikerjakan.

B.            Pertanyaan Medium Dan Larutan Pengancer

1.             Jelaskan fungsi dari masing-masing komponen dibawah ini di dalam medium :

a.    Pepton           c. Ekstrak sapi

Lampiran 2. (lanjutan)

b.    Agar              d. NaCl

2.             Jelaskan perbedaan masing-masing medium dibawah ini :

a.    Nutrien Agar

b.    Potato dextrose agar

c.    Lactose broth

d.   Plate coun agar

e.    Briliant green lactose bile broth

f.     Nutrient broth

3.             Sebut dan jelaskan klasifikasi medium !

Jawab :

1.             Fungsi masing-masing komponen :

a.              Pepton sebagai sumber protein sederhana

b.             Agar berfungsi sebagai polimer karbohidrat untuk pemaddat medium

c.              Ekstrak sapi merupakan sumber N atau protein kompleks

d.             NaCl sebagai larutan pengencer dan penghambat atau penghilang bakteri yang tidak tahan garam

2.             Perbedaan medium dibawah ini :

a.              Nutrient Agar untuk menumbuhkan bakteri karena mengandung protein yang baik untuk pertumbuhan bakteri

b.             Potato Dextrose Agar untuk menumbuhkan fungi karena mengandung karbohidrat yang baik untuk pertumbuhan fungi.

Lampiran 2. (lanjutan)

c.              Lactose Broth terbuat dari laktosa untuk mendeteksi ada tidaknya coliform dalam bahan pangan

d.             Plate Count Agar untuk menumbuhkan mikroba pada permukaan sehingga membentuk koloni yang dapat dilihat

e.              Briliant Green Lactose Bile Broth merupakan media yang spesifik dan baik untuk pertumbuhan bakteri

f.              Nutrient Broth

3.             Klasifikasi medium

·                Berdasarkan susunan kimianya :

a)             Medium anorganik        c) Medium sintetik

b)             Medium organik            d) Medium non-sintetik

·                Berdasakan konsistensinya :

a)             Medium cair / liquid medium

b)             Medium padat / solid medium

c)             Medium setengsh padat / semi solid medium

·                Berdasarkan fungsinya : 

a)             Medium diperkaya        e) Medium perhitungan

b)             Medium selektif            f) Medium khusus

c)             Medium diferensial

d)            Medium penguji

Lampiran 2. (lanjutan)

C.           Pertanyaan Metode Hitung Cawan

1.             Bagaimana prosedur perhitungan total mikroba pada sampel susu bubuk hingga pengenceran 10^-5. Hitung pula kebutuhan alat dan bahan!

2.             Laporkan “Standar Plate Count” dari sampel dibawah ini :

Sampel	Pengenceran				SPC
	10-2	10-3	10-4	10-5
Kaldu daging	280 262	45 28	3 1	- -
Susu segar	TBUD TBUD	TBUD TBUD	708 782	158 302
Sosis	TBUD	294	35	5
Dendeng	55	15	1	0

Jawab :

1.             Prosedur perhitungan total mikroba pada sampel susu bubuk hingga pengenceran 10^-5. Hitung kebutuhan alat dan bahan :

Alat                 : tabung reaksi, cawan petri, pipet, penghisap, erlenmeyer, bunsen

Bahan              : sampel yang akan di hitung (bakteri/jamur/mikroba), medium

Prosedur          : menyiapkan dan memberi label pengencer dan cawan petri steril sesuai dengan pengenceran dan pemupukan yang ditetapkan. Melakukan pengenceran sampai tingkat pengenceran yang ditentukan (melakukan sampai

Lampiran 2. (lanjutan)

tingkat pengenceran 10^-5 pada bahan yang busuk). Melakukan pencawanan pada 4 tingkat pengenceran yang terakhir dan memasukkan pada cawan petri.

2.             Laporkan “Standar Plate Count” dari sampel dibawah ini :

Sampel	Pengenceran				SPC
	10-2	10-3	10-4	10-5
Kaldu daging	280 262	45 28	3 1	- -	2,8 x 104 2,6 x 104
Susu segar	TBUD TBUD	TBUD TBUD	708 782	158 302	1,6 x 107 3,0 x 107
Sosis	TBUD	294	35	5	2,9 x 105
Dendeng	55	15	1	0	5,5 x 103

D.           Pertanyaan Pewarnaan Bakteri

1.             Jelaskan perbedaan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif!

2.             Sebutkan jenis dan bentuk koloni bakteri yang termasuk patogen!

Jawab :

1.             Perbedaan bakteri gram positif dan negatif :

Ø  Gram positif :

·           Tidak mengalami dekolorisasi karena tetap mengikat warna ungu kristal violet

·           Pada tahap akhir pengecatan tidak terwarnai safranin

·           Memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal

·           tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama

Lampiran 2. (lanjutan)

Ø   Gram negatif :

·           Mengalami dekolorisasi oleh alcohol

·           Pada tahap akhir pengecatan terwarnai menjadi merah oleh safranin

·           Memiliki 3 lapisan dinding sel

·           Tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek

Lampiran 3. Hasil Perhitungan SPC

Perthitungan SPC untuk sampel cari  :

Medium NA pengenceran  =      Jumlah koloni x                      1         

                                                                          Faktor Pengencer

                                    =      48 x   1

                                                    10^-3

                                    =      4,8 x 10^-4

SPC     =          61        =          6,1 x 10^-4

       10^-3                                                

169 x

Medium APDA                                      1

                                              10^-4

                                =      1690000

98 x

                        =      1,7 x 10⁶

                                                              1

                                            10^-5

                        =      9800000

                        =      9,8 x 10⁶

=

5750000

=

                                                (1700000+9800000)  

                                                               2

Lampiran 4. Laporan Hasil Praktikum

Lampiran 4. (Lanjutan)

Lampiran 4. (Lanjutan)

Lampiran 4. (Lanjutan)

Lampiran 5. Fotokopi Literatur

Lampiran 5. (lanjutan)

Lampiran 5. (lanjutan)

Lampiran 5. (lanjutan)

Lampiran 5. (lanjutan)

Lampiran 5. (lanjutan)

Lampiran 5. (lanjutan)

Lampiran 5. (lanjutan)